Moleculaire biologie: Chapter 12: Transcription activators in Eukaryotes



Dovnload 5.57 Mb.
Pagina9/10
Datum07.11.2017
Grootte5.57 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

Transcription factories


De aanwezigheid van DNA lussen is niet in tegenspraak met het concept van transcription factories. Dit zijn plaatsen in de kern waarde transcriptie van verschillende genen zal plaatsgrijpen. Als er twee of meer actieve genen op hetzelfde chromosoom zijn geclusterd in dezelfde transcriptie factory, zal dit lijden tot de vorming van lussen. Dus het bestaan van transcition factories impliceert het bestaan van DNA lussen. In de jaren 1990, leverde verschillende onderzoeksgroepen bewijs voor het bestaan van transcription factories. Hierbij rezen onmiddellijk de volgende vragen: (1) hoeveel transcription factories zijn er aanwezig in een kern en (2) hoeveel polymerasen komen er in een transcription factory voor.

Om het aantal transcription factories te tellen voerde Cook et al in 1998 volgend experiment uit.



De aangroeiende RNA keten in HeLa cellen werd gelabeld met bromouridine (BrU). De BrU labeling werd gedetecteerd door de cellen permeabel te maken en de ketens in vitro verder te labelen met biotine-CTP. Het gelabeld RNA werd gedetecteerd met primaire AL tegen BrU of biotine, en secundaire AL die gelabeld zijn met goud partikkels. Onderstaande figuur geeft hier de resultaten van weer. Hierop is te zien dat de transcriptie op specifieke plaatsen in de nucleus plaatsgrijpt en niet uniform verspreid over de gehele kern. In dit onderzoek werd ook aangetoonddat er gemiddeld 14 RNA polymerasen per fabriek voorkomen.

De vraag die men zich ook stelt is of het RNA polymerase over het template beweegt, of dat het DNA zich voortbeweegt door het RNA polymerase. Rescente data tonen aan dat het waarschijnlijk is het RNA polymerase zich niet voortbeweegt. Deze aanwijzingen zijn tot stand gekomen door gebruik te maken van de techniek Chromosome capture conformation (3C). Het principe van deze techniek is weergegeven in onderstaande figuur:



  1. Neem chroamtine, waarvan wordt verwacht dat er inderacties in plaatsgrijpen tussen twee DNA bindende proteïnen. De Chromosoomsegmenten kunnen zowel gelegen zijn op hetzelfde als op twee verschillende chromosomen. De twe segmenten worden aan elkaar gecroslinked met behulp van formaldehyde.

  2. Het chormatine wordt in een volgende stap ontdaan van zijn proteïnen.

  3. Het DNA wordt behandeld met een restrictie-enzym (pijlen geven de RE herkenningssite aan).

  4. Voer een ligatie uit onder zulke condities dat intramoleculaire ligatie wordt bevoordeeld.

  5. Voer een PCR reactie uit op het 3C template. Als er een significante hoeveelheid PCR product wordt aangemaakt, toont dit aan dat de chromosoom segmenten, die worden geamplificeerd door de primers waarschijnlijk dicht in elkaars buurt zitten in het chromatine.

Onderstaande figuur geeft weer hoe deze techniek is toegepast voor het aantonen dat de RNA polymerasen niet bewegen:



Uit deze resultaten werd volgend model voor de regulatie van de transcriptie voorgesteld: