Moleculaire biologie: Chapter 12: Transcription activators in Eukaryotes



Dovnload 5.57 Mb.
Pagina7/10
Datum07.11.2017
Grootte5.57 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

Independence of the domains of activators


De domeinen in transcriptie activators zijn fysiek van elkaar gescheiden op de proteïnen, ze vouwen zich onafhankelijk van elkaar om zo verschillende driedimensionale structuren te vormen. De onafhankelijkheid van de verschillende domeinen werd aangetoond door Brent en Ptashne door de vorming van een chimere constructie die opgebouwd was uit een DNA bindend domien van één proteïne en het activerende domein van een ander. Volgende proteïnen werden egebruikt: GAL4 en LexA. De DNA bindingsdomeinen en de activatiedomeinen van GAL4 zijn al eerder besproken. LexA is een prokaryote repressor, die bind op de laxA operator en zo de downstream gelegen genen represseert in E.coli. Normaalgezien heeft dit proteïne geen activatiedomein, daar dit niet de functie van het proteïne is. Door recombinatie van delen van de genen van beide proteïnen creëerden Brent en Ptashne een chimeer ge, dat een hybride proteïne zal coderen. Om de activiteit van het chimere proteïne te kunnen meten, werden twee plasmiden in gistcellen ingebracht. Het erste plasmide bevatte het chimere gen en het tweede bevatte een promotor die gevoelig is voor activatie door GAL4. Deze promotor werd gekoppeld aan het E.coli β-galactosidase gen (=reporter gen, om de transcriptie vanaf de GAL4 gevoelige promotor te kunnen meten).

No een extra elment is nodig voor deze aasay, namelijk een bindingsplaats voor het chimere proteïne. GAL4 herkend een upstream enhancer UASG. Deze zal niet worden herkend door het chimere construct, daar het DNA bindend domein afkomstig is van LexA. Om de GAL1 promotor gevoelig te maken voor activatie, werd de laxA operator ingebouwd. De vraag is nu of het chimere construct de genexpressie kon activeren. Hierop is het antwoord ja, zoals in onderstaande figuur wordt geïllustreerd. Drie plasmiden met het β-galactosidase gen werden gebruikt. 1 ervan bevatte UASG, de tweede de lexA operator en de derde bevatte geen herkenningssequentie. De gebruikte activator was ofwel LexA-GAL4 of LexA (negatieve controle). Als het UAGS element aanwezig is, dan werd steeds een grote hoeveelheid transcriptie waargenomen, onafhankelijk van welke activator werd toegevegd. De verklaring hiervoor is dat gistcellen het gen in hun genoom aanwezig hebben om GAL4 aan te maken, en zo de transcriptie kan activeren via UASG. Als er geen herkenningsplaats aanwezig is, werd er geen β-galactosidase aangemaakt. Als de laxA operator aanwezig is, kon het chimere LexA-GAL4 de β-galactosidase productie activeren met een 500-voud. Hiermee is aangetoond dat het DNA bindend domein van GAL4 kan vervangen worden door een DNA bindend domein van een niet gerelateerd proteïne en toch nog steeds een functionele activator bekomen. Dit toont aan dat de DNA bindende en transcriptie activerende domeinen redelijk onafhankelijk van elkaar kunnen werken.



  1. Function of activators


In bacteriën is het core RNA polymerase niet in staat om transcriptie van enige betekenis te initiëren. Het RNA holoënzym echter kan wel een basale hoeveelheid transcriptie katalyseren. Basale hoeveelheden zijn vaak onvoldoende voor zwakke promotors. Om dit probleem op te lossen hebben cellen activators om de transcriptiegraad te verhogen. Het proces dat ervoor zorgt dat deze verhoging optreed is recrutering.

Eukaryote activators rekruteren ook het RNA polymerase naar de promotors. Dit gebeurd echter niet via een zo directe weg als bij de prokaryoten. De eukaryoten stimuleren de binding van algemene transcriptiefactoren en RNA polymerase op de promotor. Onderstaande figuur geeft de twee hypothesen weer die voor eukaryote rekrutering gelden.


In de eerste hypothese (figuur a) zullende de algemene transcriptiefactoren één na een binden op het RNA polymerase om zo een pre-initiatiecomplex ter vormen. In de tweede hypothese (figuur b) zijn de algemene transcriptiefactoren en a de andere proteïnen al gebonden op het RNA polymerase in een complex dat het RNA polymerase II holoënzym genoemd wordt. De factoren en het polymerase worden als één complex naar de promotor gerekruteerd.




  1. Deel met je vrienden:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


De database wordt beschermd door het auteursrecht ©tand.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina